격자광시트현미경에 적용된 다양한 패턴의 정량분석

Nature Communications 13권, 기사 번호: 4607(2022) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

광시트 현미경은 광독성과 배경을 줄이고 광시야 및 공초점 현미경에 비해 이미징 속도를 향상시킵니다. 그러나 가우시안 빔을 장착한 경우 광시트 현미경의 축 분해능과 관찰 가능한 시야는 반비례합니다. 디더링된 광학 격자를 기반으로 하는 광 시트는 축 방향으로 구조화된 조명 패턴을 사용하여 가우시안 빔에 비해 축 해상도와 빔 균일성을 향상시킵니다. 그러나 이러한 장점은 시편에 대한 전체 조명이 증가하고 조명 패턴의 축 방향 제한이 감소하는 대가로 발생합니다. 고정 및 라이브 셀의 시뮬레이션 및 실험 측정을 사용하여 빔 균일성, 축 해상도, 측면 해상도 및 광표백에 대한 가우스 광 시트와 격자 광 시트 간의 차이를 정량화합니다. 우리는 축 해상도 또는 광학 단면의 우선 순위를 지정하기 위해 다양한 광학 격자 조명 패턴을 조정하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 고해상도와 낮은 배경 이미지를 모두 달성하기 위해 보완적인 광학 특성을 갖춘 다양한 격자 광 시트 패턴의 순차적 획득을 스펙트럼적으로 융합하는 접근 방식을 소개합니다.

지난 20년 동안 광시트 현미경은 단일 분자부터 전체 유기체에 이르기까지 다양한 규모의 생물학적 샘플을 이미지화하는 데 사용되었습니다. 광시트 현미경은 표본의 얇은 평면만 조명합니다. 이는 초점이 맞지 않는 조명을 최소화하고 광표백을 줄이며 표면형광 및 공초점 현미경에 비해 신호 대 잡음비(SNR)를 높입니다. 또한, 형광 현미경 검사법에서 전체 PSF(점 확산 함수)는 여기 PSF와 검출 PSF의 곱입니다. 따라서 조명 패턴이 감지 피사계 심도와 비슷하거나 얇다면 단일 평면 조명도 축 해상도를 향상시킬 수 있습니다. 공초점과 같은 점 스캐닝 방법도 축 해상도와 광학 단면을 향상시키지만, 광시야 감지 기능이 있는 평면 조명을 사용하면 광표백을 크게 낮추면서 이미징 속도를 100~1000배 더 빠르게 할 수 있습니다5.

광시트 현미경의 가장 일반적인 구현은 원통형 렌즈를 사용하여 표본에서 가우스 축 강도 프로파일을 갖는 측면으로 확장된 시트에 가우스 빔의 초점을 맞춥니다. 이 접근법은 광 시트의 두께와 전파 길이 사이에 본질적인 균형을 초래합니다. 더 얇은 가우스 광 시트는 더 높은 축 해상도와 광학 단면을 제공하지만 전파 길이가 더 짧고 시야가 더 작아집니다. 대조적으로, 두꺼운 가우시안 라이트 시트는 더 넓은 영역을 이미징할 수 있지만 해상도와 광학 단면이 낮습니다. 이러한 장단점을 극복하기 위해 많은 그룹에서는 Bessel 빔6,7, Airy 빔8,9 및 광학 격자2,10을 포함하여 조명용 구조광 시트를 사용하여 축 해상도를 빔의 전파 길이에서 분리하도록 제안했습니다. 실제로 이러한 이상화된 비회절 빔은 무한한 에너지를 필요로 하며 물리적으로 실현될 수 없습니다. 대신에 생성되는 것은 가우시안 빔과 비회절 빔(예: 베셀-가우스 또는 격자-가우스)이 혼합된 빔입니다. 여기서 조명 패턴은 축 방향으로 분포된 감쇠 엔벨로프에 의해 경계가 지정되어 조명 에너지를 단일 평면 주위로 제한합니다. 표본. 샘플에서 감쇠 범위의 폭을 변경하거나 동등하게 kz(검출 대물렌즈의 축 방향이기도 함)를 따라 여기 대물렌즈의 후면 초점 평면에서 조명의 강도 분포를 분산하면 사용자가 문자를 조정할 수 있습니다. 생물학적 샘플 및 이미징 목표에 따라 전파 길이, 축 해상도 또는 광학 단면을 선호하도록 조명 패턴을 조정합니다.